Kultur jaringan

Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan dengan kondisi aseptik, sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri tumbuh menjadi tanaman lengkap kembali.

Prinsip

Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro. Dikatakan in vitro (bahasa Latin), berarti "di dalam kaca" karena jaringan tersebut dibiakkan di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup.Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya.

Prasyarat

Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Hal yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya.

Media

Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair.Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar, dimana nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda komposisinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro. Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara makro, mikro dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman.
Nutrien yang tersedia di media berguna untuk metabolisme, dan vitamin pada media dibutuhkan oleh organisme dalam jumlah sedikit untuk regulasi. Pada media MS, tidak terdapat zat pengatur tumbuh (ZPT) oleh karena itu ZPT ditambahkan pada media (eksogen).ZPT atau hormon tumbuhan berpengaruh pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Interaksi dan keseimbangan antara ZPT yang diberikan dalam media (eksogen) dan yang diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan suatu kultur.
Penambahan hormon tumbuhan atau zat pengatur tumbuh pada jaringan parenkim dapat mengembalikan jaringan ini menjadi meristematik kembali dan berkembang menjadi jaringan adventif tempat pucuk, tunas, akar maupun daun pada lokasi yang tidak semestinya.Proses ini dikenal dengan peristiwa dediferensiasi. Dediferensiasi ditandai dengan peningkatan aktivitas pembelahan, pembesaran sel, dan perkembangan jaringan.

Beberapa jaringan yang lambat dalam pertumbuhan mereka. Bagi mereka akan ada dua pilihan: (i) Optimalisasi media tumbuh, (ii) Membudidayakan sehat dan penuh semangat tumbuh jaringan atau varietas. Necrosis bisa merusak jaringan kultur. Umumnya, nekrosis kultur jaringan bervariasi dalam varietas yang berbeda dari tanaman. Dengan demikian, dapat dikelola oleh kultur sehat dan penuh semangat tumbuh varietas.

Metode

Metode perbanyakan tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui tiga cara, yaitu melalui perbanyakan tunas dari mata tunas apikal, melalui pembentukan tunas adventif, dan embriogenesis somatik, baik secara langsung maupun melalui tahap pembentukan kalus. Ada beberapa tipe jaringan yang digunakan sebagai eksplan dalam pengerjaan kultur jaringan. Pertama adalah jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah (meristematik) sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Jaringan tipe pertama ini biasa ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Tipe jaringan yang kedua adalah jaringan parenkima, yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut adalah jaringan daun yang sudah berfotosintesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan.

Kultur jaringan atau biakan jaringan sering disebut kultur in vitro yakni teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan yang dilakukan di luar individu yang bersangkutan. In vitro berasal dari bahasa Latin yang artinya "di dalam kaca". Jadi Kultur in vitro dapat diartikan sebagai bagian jaringan yang dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Secara teoritis teknik kultur jaringan dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan, hewan, bahkan juga manusia, karena berdasarkan teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), bahwa setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut, setiap sel berasal dari satu sel.

Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses perbanyakan tanaman dengan metoda kultur jaringan, yaitu: 
1) bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk dikulturkan; 
2) Wadah dan media tumbuh yang steril. 
3) Lingkungan tumbuh.

Media Tumbuh

Media tumbuh untuk perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Media tersebut berfungsi untuk penyediaan air, hara mineral, vitamin, zat pengatur tumbuh, akses ke atmosfer untuk pertukaran gas, dan pembuangan sisa metabolisme tanaman pada proses regenerasi kultur jaringan (Kultur in vitro).

Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar (dari rumput laut) atau pengganti agar seperti Gelrite atau Phytagel (bersumber dari bakteri). Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7-1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin kadang-kadang digunakan pada lab komersial. Gel sintetis diketahui dapat menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media.

Di dalam media terkandung : 
1> unsur-unsur mineral makro (Nitrogen (N) 25-60 mM, Kalium, Fosfor (P) 1-3 mM, Kalsium (Ca) 1-3 mM, Magnesium (Mg) 1-3 mM, Sulfur (S) 1-3 mM)); 
2> unsur-unsur mikro (Besi (Fe) 1 m M, Mangan (Mn) 5-30 m M, Seng (Zn), Boron (B), Tembaga (Cu) 0.1 m M, Molybdenum (Mo) 1 m M, Cobalt (Co) 0.1 m M, Iodine (I) Nickel (Ni), aluminum (Al), and silicon (Si)); 
3> senyawa organik (gula, sukrosa, dan lainnya) 20 to 40 g/l; 4> vitamin (thiamin (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (B6), dan myo-inositol); 
4> arang aktif; dan 
5> Zat pengatur tumbuh, yang bisa digunakan, yakni: dari golongan auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA), golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA, dan golongan Gibberelin seperti GA3.
Bahan Bagian Tanaman (Eksplan)

Eksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan untuk perbanyakan tanaman dengan metoda kultur jaringan (kultur in vitro) adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.
Lingkungan Tumbuh

Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi pH, temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.
Proses Perbanyakan Tanaman dengan Teknik Kultur Jaringan

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:

1) Pembuatan media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.

2) Untuk pengambilan eksplan, bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

3) Lakukan sterilisasi yaitu segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Peralatan juga harus disterilkan dengan menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatann.

4) Perbanyakan calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

5) Pengamatan pada fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

6) Pemindahan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan menggunakan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya. Sungkup dilepaskan secara bertahap, selanjutnya pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan pada bibit generatif.

Kultur jaringan mempunyai dua kontribusi penting dalam pemuliaan sawit yaitu untuk pembiakan massal secara vegetatif dan untuk regenerasi jaringan yang telah ditransform oleh gen pengendali sifat tertentu dalam proses rekayasa genetika.
Observasi di lapang menunjukkan bahwa tanaman klon asal kultur jaringan mampumenghasilkan TBS 30-40% lebih tinggi dari produksi TBS tanaman asal benih. Peningkatan produksi terjadi karena tanaman secara genetik homogen dan pohon induk yang digunakan dipilih 5% terbaik dari populasi DxP. Di Indonesia, pengembangan klon melalui teknologi kultur jaringan ini sedang dilakukan oleh PPKS, PT Socfindo, maupun PT London Sumatra Indonesia Tbk (Lonsum). sebagian besar dalam skala penelitian. Strategi kultur jaringan juga dimanfaatkan oleh PT Binasawit Makmur (Sampoerna Agro) untuk mengkaji potensi benih semi-klonal yang merupakan hibridisasi antara dura ex-seedling x pisifera klon

Kegiatan kultur jaringan di Sumatera Biosience yaitu
1. Retritment yaitu ramet dimasukkan ke media yang berisi hormon lalu dipotong petak-petak
2. Eksplan menggunakan media arang aktif
3. Kaluginasi yaitu pembentukan kalus
4. Embrio Shooting yaitu pembentukan tunas dalam kultur jaringan dengan menggunakan hormon sitokinin
5. Embrio Rooting yaitu pembentukan akar dengan merubah honman yaitu menaikkan hormon auksin
6. Hardening yaitu tanaman yang sudah siap untuk di aklimatisasi
7. Aklimatisasi yaitu menyesuaikan tanaman kelingkungan luar

MARKA DNA
Fungsi marka DNA untuk menseleksi dan memastikan keberadaan DNA asing dengan melakukan penentuan urutan nukleutida fragmen DNA asing tersebut. Dengan teknik ini maka sekaligus akan diketahui secara rinci urutan nukleotida gen asingyang di klon sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut, teknik ini biasanya hanya dilakukan teknik analisa DNA rekombinan yang lebih sederhana, lebih karena teknik ini hanya digunakan untuk karakteristik secara rinci gen yang diklon 

ISSR
ISSR (untuk mengulang urutan antar-sederhana) adalah istilah umum untuk daerah genom antara lokus mikrosatelit. Urutan melengkapi dua microsatellites tetangga digunakan sebagai primer.

PCR

wilayah variabel antara mereka mendapat diperkuat. Panjang dibatasi selama siklus amplifikasi PCR mencegah terlalu berlebihan replikasi DNA sekuens panjang berdekatan, sehingga hasilnya akan campuran dari berbagai alur amplifikasi DNA, yang pada umumnya pendek tapi banyak bervariasi panjangnya. Urutan diperkuat oleh ISSR-PCR dapat digunakan untuk sidik jari DNA.

SSR
SSR yang membentang 1 sampai 6 unit nukleotida berulang dalam tandem dan secara acak yang tersebar di genom eukariotik. SSR sangat polimorfik karena laju mutasi yang tinggi mempengaruhi jumlah unit ulangi. Seperti panjang-polimorfisme dapat dengan mudah terdeteksi pada gel resolusi tinggi (misalnya gel sequencing), dengan menjalankan PCR amplifikasi fragmen yang diperoleh dengan menggunakan sepasang primer yang unik mengapit ulang.

AFLP
Teknik ini didasarkan pada deteksi genom amplifikasi fragmen restriksi oleh PCR dan dapat digunakan untuk DNA asal atau apapun kompleksitas. Sidik jari adalah dihasilkan, tanpa pengetahuan sebelumnya urutan, menggunakan terbatas set primer generik. Jumlah fragmen dideteksi dalam reaksi tunggal dapat 'tuned' dengan pemilihan primer spesifik set. Teknik ini dapat diandalkan dan sangat berguna dalam deteksi polimorfisme antara terkait erat dengan genotipe .

SNP
Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP, diucapkan snip) adalah variasi sekuens DNA terjadi ketika sebuah nukleotida tunggal - A, T, C, atau G - dalam genom (atau urutan bersama lainnya) berbeda antara anggota sebuah spesies (atau antara pasangan kromosom dalam individu).

PCR
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.

RFLP
Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi (bahasa Inggris: Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP) merupakan penanda molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim yang mampu mengenal dan memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6 urutan basa).

RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) merupakan metode perbanyakan genom yang paling sering digunakan karena sangat mudah dan membutuhkan jumlah DNA genom yang tidak terlalu banyak. 

Mikro satelite
Mikrosatelit adalah sekuen sederhana yang berulang-ulang yang melimpah dalam genom suatu spesies. Mikrosatelit memiliki pengulangan sekuen yang berurutan dua sampai 4 motif sekuen nukleotida sebagai sekuen konservatif. Marka ini sangat berguna sebagai marka genetik karena bersifa1: kodominan, sehingga dapat mendeteksi keragaman alel pada level yang tinggi, mudah dan ekonomis dalam pengaplikasiannya karena menggunakan proses PCR.

Sumber lebih lengkap dapat dilihat di :

http://khairulnasution.blogspot.com/2011/10/mekanisme-produksi-benih-dan.html

http://www.ideelok.com/budidaya-tanaman/perbanyakan-tanaman-dengan-kultur-jaringan 
http://id.wikipedia.org/wiki/Kultur_jaringan